一、获取细胞裂解液

• 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

• 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendoff管

• 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞

• 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min

• 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃

二、制备磁珠-抗体

• 重悬磁珠

• 标记实验所需的eppendoff管

• 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管

• 每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡

• 将eppendoff管置于磁力架上，去上清，重复一次

• 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠

• 室温孵育30min

• 将eppendoff管置于磁力架上，弃上清

• 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次

• 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上

三、RNA结合蛋白免疫沉淀

• 准备RIP Immunoprecipitation Buffer

• 将前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

• 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml

• 4℃孵育3h至过夜

• 短暂离心，将eppendoff管放在磁力架上，弃上清

• 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次

四、RNA纯化

• 准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul

• 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物

• 55℃孵育30min

• 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中

• 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer

• 于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡，室温下14,000rpm离心10min

• 小心吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管

• 于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min

• 小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管

• 每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜

• 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清

• 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.

• 10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存。

文章出自：细胞实验外包    想了解更多请关注：http://www.bestmmorpg2016.com