免疫组化，即免疫组织化学技术，是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位、定性的实验技术。

操作步骤

01

切片：

包埋好的蜡块用切片机进行切片

将切成的蜡带平铺在水浴锅中

等待切片完全展开后有防脱载玻片轻轻将切片捞起，使其贴在载玻片上

将载玻片放在切片架上

02

烘片：70℃烘片30-40min

03

脱蜡水化：将切片依次浸入以下溶液

二甲苯Ⅰ15min

二甲苯Ⅱ15min

无水乙醇5min

90%乙醇3min

80%乙醇3min

70%乙醇3min

蒸馏水3min*3次

PBS 3min*3次

04

阻断内源性过氧化物酶：

将3%过氧化氢倒入染色缸

将切片放入染色缸中

避光孵育20min

将切片浸泡于PBS 3min*3次

05

抗原修复：

将柠檬酸钠稀释50倍

将10mL的50x缓冲液中加入到1L的烧杯中，再加入490mL的蒸馏水，玻璃棒搅拌均匀

用微波炉煮沸

将组织切片放入烧杯中

调至中火（P50），保温20min

修复结束后，将烧杯拿出，烧杯和切片一同室温冷却至室温（注：不要将切片从烧杯中拿出）

PBS 3min*3次

06

封闭：

用吸水纸将组织周围的水小心吸干净

用免疫组化笔在组织周围画圈以防止后续抗体流出

在圈中滴加5%山羊血清封闭液至覆盖组织

将切片平放于湿盒中，室温孵育30min

07

一抗孵育：

甩掉封闭液，滴加一抗使其覆盖组织

放入湿盒中，4℃孵育过夜

08

清洗：

第二天取出湿盒后，室温复温30min

回收一抗

将切片依次浸入PBS 3min*3次，蒸馏水5min*2次

09

二抗孵育：

切片甩干水分并吸走水珠

滴加二抗使其覆盖组织

室温孵育120min或4℃孵育过夜

10

DAB显色：

将二抗回收至干净的1.5mL的离心管中

用PBS浸洗切片3min*3次

甩去多余的PBS

在切片上滴加DAB显色液

观察切片染色情况，棕黄色为阳性，染色明显即可用蒸馏水冲洗玻片终止显色

11

复染细胞核：将切片置于苏木素中复染2min，细胞核变蓝色即可终止，并用自来水冲洗

12

分化：将切片置于1%盐酸乙醇中分化5s，使组织由蓝色变成棕黄色，然后自来水冲洗3min

13

脱水：将切片依次浸入以下溶液

70%乙醇1min

80%乙醇1min

95%乙醇2min

100%乙醇4min

14

封片：切片铺平晾干后，滴加适量中性树胶封片

文章出自：细胞实验外包    想了解更多请关注：http://www.do-gene.com/