一、实验材料
无水乙醇，二甲苯，固定液，PBS，软蜡（50-54℃），硬蜡（58-62℃），载玻片（世泰粘附性载玻片）
二、实验仪器
HD-310型生物组织自动包埋机
HD-310型包埋机专用冷冻台
轮转式切片机
HD-330型摊片烤片机
三、溶液配制
1. 固定液
组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。
固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。
固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快。，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。
常用固定液：1、10%甲醛溶液 (甲醛：水=1：3)
2、无水乙醇
3、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）
2. PBS
10*PBS Nacl79g Kcl20g K2HPO418g KH2PO4 14.4g
定容至1L PH调至7.4
稀释10倍可得1*PBS
3. 不同浓度乙醇
75%乙醇（无水乙醇：水=3:1）
80%乙醇（无水乙醇：水=4:1）
90%乙醇（无水乙醇：水=9:1）
95%乙醇（无水乙醇：水=19:1）
4.脱钙液
乙二胺四乙酸（EDTA) 5.5g
1%甲醛定容至100ml
四、实验方法
1. 取材
材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。
(1) 材料选择时须尽可能不损伤所需要的部分，动物组织取材建议灌流后取材，冲去过多血液。
(2) 取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。
(3) 切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。
(4) 切取的材料应该小而�。阌诠潭裂杆偕肽诓�。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2（约黄豆粒大�。�。
2. 固定
组织与固定液体积比应在1:20以上，10%甲醛固定2天以上。若固定液选择无水乙醇或Carnoy改良液，固定时间应控制在半天左右。
10%甲醛固定后的组织水洗20min*3次。若固定液选择无水乙醇或Carnoy改良液，不得水洗
脱钙：将骨组织按1:20浸泡于脱钙液中，
每三天更换一次脱钙液，共浸泡14至21天
脱钙完成后，用针刺入骨组织若无阻碍刺穿则脱钙完成，
若有阻力则脱钙未完成，继续浸泡脱钙液，三天一次针刺观察。
3. 脱水
生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除�。饩褪峭阉淖饔�。
脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。
常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从50％乙醇开始，经过75%、80%、90%、95%、100%至完全脱水。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置1到2h不等，如果中间须停顿，大部分材料停留在75%乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
1) 水洗后组织于5ml离心管内
2) 75%乙醇脱水1 h-2 h或过夜（此步骤可根据实验时间安排选择是否过夜）
3) 80%乙醇脱水1 h-2 h
4) 90%乙醇脱水1 h
5) 95%乙醇脱水0.5 h或者过夜（此步可过夜组织仅限于肝，脑，肌肉等含水量多的组织）
6) 无水乙醇脱水 20 min两次（依据含水量多少，脱水20-60min）
7) 无水乙醇+二甲苯1:1 20min。（进行过渡，以防脱水不彻底）
4. 透明
1) 二甲苯透明20 min。
2) 二甲苯 依据透明状况来看10min-60min。（透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，若脱水不彻底，组织中有白色云雾状，则重新更换无水乙醇加二甲苯1:1混合溶液。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。
5. 浸蜡
1) 软蜡 1h
2) 软蜡 2h
3) 硬蜡2h
6. 组织包埋
1) 包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。
2) 包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好模具，将组织平放在模具底部，切面朝下后将包埋盒盖在模具上，将熔蜡倒入模具内至蜡液溢出模具后，再轻轻提起模具，平放在冰冻台中，待其迅速冷却凝固约10min后取出。
包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。
7. 切片
1) 切片方法
切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。
2) 切片中存在的问题及补救方法
石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功，有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣，甚至完全失败。现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救办法陈列出来
切片存在问题及解决方案：
缺 点：石蜡带弯曲不直
原 因：①石蜡块上下两边不平行
②石蜡块的上下两边不和刀口平行
③刀口锋利不一，局部产生差异
④蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致
⑤材料未居蜡块正中央
⑥材料大而形不正
补救办法： ① 取下台木，将两边修干
② 调节标本台，使两者平行
③ 移动刀片，改用新的刀口
④ 待蜡块冷却后再切，或重新包埋
⑤ 用刀片切去部分石蜡，使材料居中
⑥ 在大的一边切去少许石蜡
缺 点：切片分离、不能连成带状
原 因：①室温过低 ②石蜡过硬 ③材料边缘留蜡太少 ④刀的角度不适合
补救办法：①在切片机上方开一电灯或提高室温
②在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面
③重新包埋
④矫正刀的角度
缺 点：切片卷起呈圆筒状
原 因：①室温过低 ②石蜡过硬 ③刀口太钝 ④刀的倾角太大
补救办法 ：①提高室温
②加软蜡
③用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成带
④减小倾角
缺 点：切片粘附于切片刀，皱摺在一起
原 因：①室温过高 ②石蜡过软 ③刀口上留有一层石蜡 ④刀口钝
补救办法：①降低室温
②将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加
③切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡
④磨刀或移动刀口
缺 点：切片纵裂
原 因：①刀有缺口
②石蜡块中含有颗粒、杂质
③刀口留有碎屑或细丝
④组织太硬
补救办法：①可移动刀口
②将颗粒拽去
③清洁刀口
④让包埋块在水中浸泡
缺 点：切片有横纹
原 因：①刀和台木的固定螺丝太松 ②刀口倾斜度太大 ③刀口有石蜡屑
补救办法：①旋紧螺旋 ②可放平后再切 ③用氯仿拭去
缺 点：切片厚薄不匀
原 因：①切片机有毛病
②夹刀不当
③未旋紧标本台螺旋
④石蜡块过硬
补救办法：①矫正切片机装置
②对症治疗
③旋紧螺旋
④将石蜡块在水中浸泡
缺 点：每张切片厚薄不匀
原 因：①刀口震动，是由于材料过硬 ②刀的倾角太大
补救办法：①在蜡块表面涂一层火棉胶 ②减小倾角
缺 点：材料发生裂隙破碎或脱落
原 因：①脱水不干净
②有透明剂残留
③石蜡透入时，温度过高或时间过长
④由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆
⑤材料太硬或太粗
补救办法：①无法弥补
②增加浸蜡时间，重新包埋
③无法补救
④用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明
⑤在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液
缺 点：切片时发生沙沙声
原 因：①组织块过硬 ②包埋温度过高 ③材料内留有结晶体
补救办法：①浸泡水中软化 ②无法补救 ③无法补救
缺 点：石蜡块将蜡带抬起
原 因：①由于摩擦而产生静电荷所致
②石蜡块上面附有石蜡碎屑
③刀口上附有石蜡碎屑
补救办法：①提高室温
②用刀片将碎屑清除
③用二甲苯或氧仿清除
8. 展片
首先将切片分割开，投入到48℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，将粘附性载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置。50℃拷片30min以上
9. 脱蜡及复水
二甲苯 20min
二甲苯 20min
100% 乙醇 20min
90% 乙醇 2-3min
80% 乙醇 2-3min
70% 乙醇 2-3min
五、病理切片实验室的清洁和仪器使用管理
按照抽屉标明摆放物品，毛刷、镊子等需要定期检查更换。
六、仪器和耗材的维护
仪器使用做好登记
常规耗材包括：刀片，软蜡，硬蜡，载玻片，无水乙醇，二甲苯，甲醛
不常用耗材：镊子、毛刷
