脑立体定位技术是精确确定脑结构特定位置的技术，被广泛运用于脑的损毁、刺激和脑电记录的精确定位中，成为研究脑结构和功能必不可少的工具。本文详细介绍了脑立体定位病毒注射操作实验操作流程，供大家在实验操作时参考。

脑立体定位病毒注射具体操作步骤：

1.查阅图谱，确定注射位点坐标

2.玻璃电极和微量进样器准备

微量进样器和玻璃电极中分别灌注液体石蜡油，然后把电极套在微量进样器尖端，保证里面没有气泡，然后用热熔胶密封连接处，静置待胶凝固。把制作好的微量进样器固定在立体定位仪上，确保进样器垂直并且牢固的固定在定位仪上。

3.老鼠麻醉与固定

用5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，大约5分钟后动物进入深层麻醉状态。用剃毛器把头骨上面的毛剃干净，将小鼠固定在适配器上，眼睛涂抹眼膏。将双侧耳杆固定在小鼠的外耳道，微调使左右耳杆刻度一致并拧紧螺丝，使小鼠的头处于正中。将小鼠的门齿固定于适配器门齿固定器上，门齿夹不宜拧太紧。

4.鼠脑调平

暴露颅骨：70%酒精消毒小鼠头皮，随后用剪刀将头皮剪开一条长约2cm的创口，用干的卫生棉球擦掉颅骨表面的软组织，完全暴露颅骨。

定前囟：将注射针尖移至中缝线靠前部位，接触颅骨表面，以前囟位置（bregma点）为参考点，刚接触到表面时，停针，将数字显示仪的X，Y，Z轴坐标读数归零。下针的时候，用显微镜观察针尖位置，以免折断针头！

左右调平：将进样器向上提起少许，以免碰到颅骨表面，然后以bregma为中点左右移动相同的距离（推荐3.0mm/2.5mm/2mm）并下针接触颅骨表面，分别读对应点Z坐标，通过Z坐标的数值来确定左右是否齐平，如果读数相差0.03mm以内，则认为小鼠脑袋左右齐平。通过调整两边的耳杆高度将左右调平，调整过程中，移动耳杆后必须重新定位bregma零点。

前后调平：前囟点和后囟点调平，方法同左右调平。

5.病毒注射

开颅：调平后，通过数显仪开始定位自己的目标脑区，以VTA坐标为例，AP:-3.2mm ML:±0.45mm DV:-4.3mm，Y轴向后移动3.2mm，X轴向右移动0.45mm，下针，接触颅骨表面的一瞬间停针，观察颅骨表面特征并记住或做个标记，提针至较高处，然后用颅钻在目标位点磨孔，暴露脑组织。

吸取病毒：打开控制泵，设置好需要的体积、速度和模式，用生理盐水清洗玻璃电极尖端，将针尖浸没到液面下，按start开始吸取液体，吸液结束后再用生理盐水擦拭针头。

注射：然后将进样器移至目标脑区，根据坐标开始下针，下针过程必须足够缓慢，下到目标脑区的深度，设置体积、速度（一般40-80nl/min）和模式，然后按start注射病毒。病毒注射完成后，停针10分钟，然后将注射针缓慢提起。

术后处理：用医用针线缝合头部皮肤并进行消毒，处理完后将小鼠放回鼠笼，必要时放在加热垫上保暖。

6.心脏灌流

开胸：将小鼠麻醉后固定在泡沫板上，用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀在剑突下剪一小口，向左右两侧剪开腹部皮肤。止血钳夹持剑突上提，剪开胸腹隔膜，沿左右两侧向上剪断肋骨至下颌，上翻胸廓，暴露心脏。

左心室穿针：左手用镊子轻轻夹住心脏,右手将灌流针由心尖插入左心室（此时液体是关闭上的），有落空感证明扎进去了,固定灌流针，剪开右心耳，开放血液流出通道。（注意针不能扎得太深，以免扎进右心室，进入肺循环后将影响灌流效果。）

生理盐水冲洗及4%多聚甲醛固定：打开蠕动泵开关（蠕动泵流速为35-40rpm），先用生理盐水冲，以小鼠四肢、舌头、肝脏变白了为冲洗完毕的判定指标，之后将导管放入4%多聚甲醛溶液中，待小鼠四肢及尾巴僵硬结束灌流。

7.剥取鼠脑

沿小鼠颈部剪下头颅，用箭头剪开头皮暴露白色头盖骨，将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。用镊子将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部。最后将脑下部连接的神经逐条剪断（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。

8.沉糖脱水

将剥离出来的脑浸泡在4%多聚甲醛溶液中，后固定6~24 h，之后用30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑袋会浮在液体上方，待完全脱水后脑会沉底，此时可将脑取出进行冷冻切片。

9.切片、贴片、封片

利用冰冻切片机对小鼠脑组织进行组织切片，每片厚度为40?m。将切好的脑片收集在装有防冻液（PBS:丙三醇：乙二醇=5:2:3）的24孔板中，并于-20℃冰箱保存。挑取目的脑片，用 PBS清洗3遍，每遍5 min。用 DAPI 染色10-15min后，用 PBS清洗3遍，每遍5min，将脑片贴于载玻片上，最后用70%甘油封片。

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