细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）是一种研究细胞内蛋白质相互作用的重要方法。其基本原理是，如果细胞内两种蛋白质（A和B）有直接或间接的相互作用，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入A蛋白的抗体，可以将A蛋白沉淀下来，与其直接或间接相互作用的B蛋白或C蛋白也会一起被沉淀下来。通过Western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白，可以确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 ? 用途 检测A、B蛋白在体内是否相互结合 分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 ? 材料与仪器 【样品和试剂】 293T细胞（以该细胞做转染为例） 转染质粒（Flag-A，HA-B） Flag抗体 2× loading buffer PBS Flag-beads 1× TBST 5× SDS loading buffer 蛋白酶抑制剂 磷酸酶抑制剂A和B RIPA裂解液 【实验仪器】 磁力架 金属浴 RIPA裂解液旋转混合仪 WB实验相关设备 ? 实验步骤 一、细胞的铺板与转染 提前一晚将293T细胞铺板至6cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准； 用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染2皿细胞：Flag空载+HA-B；Flag-A+HA-B；每质粒2微克。 二、免疫沉淀 转染24小时后，收获细胞，每皿加入500μL裂解液，收集细胞至1.5mL EP管中，在冰上超声破碎细胞； 超声好后，4℃，12,000g，离心30分钟，取400μL上清液用于免疫沉淀，80μL上清用作总蛋白并加入等体积的2× loading buffer； 将400μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5μg Flag抗体，4℃孵育3-4小时； 4℃，2,000g，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟； 最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60μL2×loading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸15分钟。 三、Western Blot检测 通过SDS-PAGE分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测Flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 ?? 注意事项 对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态； 如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响； 该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。

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